使用BPP分析unphased sequences時的勸世好文

https://doi.org/10.1093/sysbio/syab047

一般定序產出的雙倍型生物的單倍型共同序列(haploid consensus sequences of diploid organisms)雖然解決了異型合子的問題，但這個共同序列是根據該異型位點的核甘酸種類多寡來隨機決定的(randomly phasing)，因此這個序列可能並不真實存在在自然中，然而若使用unphased sequences又可能導致錯誤的參數估算，如利用IUPAC來編碼異型位點會傾向將分化時間計算得更古老。這篇研究比較不同phasing的方法所得到的族群遺傳參數有何不同，包含：物種樹(species tree)、有效族群量、分化時間以及種間雜交(遺傳滲漏)，以上參數都由BPP (Bayesian Phylogenetics & Phylogeography)程式來計算。

用來phasing的方法有以下四種：

(1) Full strategy (F): fully resolved sequences; serving as gold standard

(2) Analytical strategy (D): analyzing unphased sequences using diploid or phase option in BPP

(3) PHASE strategy (P): the program PHASE

(4) Random phase strategy (R): random phase resolution

序列來源則有兩種：模擬產生和真實的生物序列(青蛙和花栗鼠)。因為策略F的完全解析序列是電腦模擬產生的，所以分析真實生物序列時並不會用到策略F；另外，作者額外用 (5) Ambiguity strategy (A; IUPAC編碼異型位點)來分析青蛙和花栗鼠的序列。

先說電腦模擬的結果。在物種樹重建、分化時間和有效族群量估算方面，F、D、P、R四個策略用在deep phylogeny和低mutation rate時的表現差不多；但用在shallow phylogeny時，策略R會高估分化時間和有效族群量，策略P會低估分化時間(尤其mutation rate高的時候)，策略P和R在重建物種樹的表現不佳(尤其mutation rate高的時候)，而策略D的表現則都和策略F差不多。在估算遺傳滲漏方面，策略D和策略F的表現差不多，在低mutation rate時四個策略也表現相似；然而當用在高mutation rate時，策略R會高估遺傳滲漏率，策略P則是低估。

再來是真實生物的序列，由於策略F在這不適用，根據電腦模擬的結果策略D的表現與策略F最相似，所以這裡用策略D當作「解答」的準則。首先是青蛙，四個策略(D、P、R、A)都重建出相同的物種樹樹型；族群遺傳參數方面，策略P和策略D得出相似的結果，策略R高估有效族群量(根據族群遺傳參數θ)，策略A則嚴重低估現存支系的有效族群量(θ)和分化時間。至於花栗鼠，策略D、P、R得到相同的物種樹，但策略A得出的樹型不同；族群遺傳參數的結果則與青蛙相同。

總結來說，當用在deep phylogeny(也就是物種分化時間早於coalescent time)時，phasing策略的差異對結果影響不大；phasing error的影響主要體現在shallow phylogeny和mutation rate很高的時候。這篇研究是蠻好的分析策略應用的文章，作者給了幾個務實上的建議：

(1) 避免使用策略R和策略A，因為它們的表現比策略P還糟；

(2) 若序列中含有unphased data，推薦使用策略D，因為它的表現和策略F差不多；

(3) 若考慮到運算時間限制，策略P可作為策略D的替代方案。

不同SNP-based重建species tree的方法評估地松鼠的親緣關係

https://doi.org/10.1016/j.ympev.2022.107396

基因樹的估算錯誤是重建species tree時一個重要的誤差來源，尤其是對快速種化的類群而言。因為SNP-based的方法不依賴重建每棵基因樹，所以是個有潛力解決以上誤差的替代方法。SNP data還有運算效率較佳、適用老舊標本、較省定序成本等優點。雖然很多研究顯示SNP-based和gene tree-based的方法在重建species tree時的表現一致，但也很多發現不一致的研究，尤其是樹的枝長很短還有incomplete lineage sorting影響的時候。本研究旨在解析地松鼠的親緣關係，並評估不同datasets在重建species tree時的表現。在重建親緣關係方面，作者主要準備了兩種來源的data：

(1) UCE-derived SNPs (phased & unphased)

(2) 粒線體基因體

分析方面，作者想知道不同處理data的方法和建樹程式的表現，使用SNAPP和SVDquartets來分析phased和unphased SNPs、MrBayes來分析粒線體基因。這兩個程式分別分析下列的datasets：

(1) SNAPP

a. phased 1-3 (single phased SNP randomly selected per locus for 3 replicates)

b. consensus 1-3 (single consensus SNP randomly selected per locus for 3 replicates)

(2) SVDquartets

a. phased 1-3 (unlinked SNPs, two alleles per sample)

b. consensus 1-3 (unlinked SNPs, one allele per sample)

c. all biallelic SNPs (all phased SNPs per locus)

d. all SNPs (也是所有phased SNPs，不確定差異在哪？)

結果顯示，SNAPP和SVDquartets需要的運算時間有很大差異，SNAPP花了超過一個月來達到可接受的effective sample sizes (ESS；一般來說是ESS>200)，但SVDquartets只需要一兩天便能完成分析(當設定bootstraps=1000)；樹形和支持度也有差別，當使用phased SNPs的時候SNAPP能得到大致有不錯支持度(posterior probability>0.8)的樹，但若是unphased SNPs (也就是consensus SNPs)會得到一個稍微不同的而且支持度低很多的樹形；相反的，無論是phased或unphased SNPs，SVDquartets均產出支持度很高的樹，即使這兩種datasets得到的樹形有點不同，這會導致對SVDquartets的結果有不合理的信賴，作者也引用了一些文獻說明SVDquartets常常高估樹的支持度。因此，以這篇研究來說，作者較偏好SNAPP的結果。

Phasing與否是這篇研究另一個探討的重點，先前的研究已經顯示，對於晚近分化的種群來說，phasing對於重建其親緣關係有很大幫助。這篇研究地松鼠的結果也得到差不多的結論，使用phased SNPs能得到比較真實的分化時間估算，還有較佳的樹形解析度和支持度。然而，對於較深的演化關係(at deeper phylogenetic levels；屬級以上)而言，phased SNPs並沒有顯著改善樹的解析度和支持度，當使用三個phased datasets，SNAPP產出不一致的演化關係樹；反而是consensus datasets的三個結果為一致，而且都有高支持度。雖然phased SNPs在較高階的演化關係重建表現沒比較好，但作者認為phased data才是真實反映了incomplete lineage sorting在重建species tree時產生的衝突。

令人沮喪的第一次illumina sequencing建庫 (20250219更新troubleshooting)

記錄一下第一次做illumina squencing的library，為了捕捉UCE loci。因為太令人沮喪了所以覺得該寫下這個歷程，希望之後能找到方法改善。這次用的試劑是xGen DNA Library Prep EZ Kits，主要遇到的問題是cleanup後DNA濃度變得非常低。

有多低？因為我先前有做過ddRADseq library的經驗，老闆請人示範製備過程時主要讓另一位博士生練習，我則在旁邊拿著protocol純觀賞，我的部分樣本就變成示範教材。這是示範製備時的樣本濃度（ng/ul）：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup

ID443    20.6                  3.4
ID448    6.2                    2.
ID452    8.82                  3.24
ID453    4.88                  5.89
ID439    10.1                  4.4
ID457    7.26                  1.57
ID500    3.08                  1.67

以上是示範教學時的濃度，看起來還不錯所以我就當成標準來參考，結果我自己上陣時變得慘不忍睹：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID444    16.2                  0.596
ID446    7.8                    0.305
ID449    29.2                  0.675
ID450    8.23                  0.345
ID451    18.6                  0.593

為了保護樣本的隱私我只列出一部份，反正一樣慘多說多難過。似乎和起始的gDNA濃度沒關係，最後大家的濃度都低得很平均，會造成DNA流失的步驟只有protocol中的兩次磁珠純化，我看了researchgate上不只有我遇到這個問題（德不孤必有鄰的感覺真好），那大家的建議不外乎就是注意乾燥磁珠的時間要抓好，過乾造成龜裂或不夠乾導致酒精殘留都會影響DNA的回收率。以前我在做ddRADseq建庫時過乾似乎沒造成什麼問題，就是持續pipetting直到磁珠和水混和均勻就好了，至於不夠乾應該是沒遇過畢竟酒精揮發得很快。

目前其實我沒什麼頭緒，我能做的似乎只有縮短乾燥磁珠的時間，還有在步驟間額外插入濃度測量，看看DNA濃度變化是發生在哪一個步驟之後。另外我跑去看官方完整版的protocol後發現也可能是因為gDNA被over fragmented，這就得縮短酵素作用的時間了。等我找到方法成功trobleshooting（如果有那一天的話）再來更新這篇文章吧。

———20250219更新———

成功找到導致最後濃度極低的原因了，就只是我自己犯蠢拿錯了elution buffer。其實protocol上有寫清楚需要的是10mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)，但是我拿到了1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)，酸鹼值的不同可能會讓反應酵素失活之類的。啊不過我同事說他之前也用跟我一樣的buffer好像就沒出什麼事，這點我不知道所以先保留，可能是他記錯或不同物種導致的差異。總之換了正確的buffer後，我得到了不錯的建庫結果：

             conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID523    4.83                    24
ID524    3.21                    18.5
ID525    6                         25.7
ID526    11                       26.1
ID527    14.9                    42.2 (稀釋1.5倍後的濃度，原本太高了Qubit測不出來)

就是這樣，之前在找資料時我在ResearchGate之類的網站發現有些人也遇過類似的問題（德不孤必有鄰的感覺真好），像是建庫時DNA濃度突然驟減、拿到錯誤濃度的elution buffer怎麼辦之類的，他們的情形有可能跟我一樣，希望我的經驗可以給大家一點在troubleshooting時的想法。

關於隱蔽支系的物種界定務實操作上的建議

 

https://doi.org/10.1093/sysbio/syy026

種化在不同維度上的速率可能是不一樣的，因此會出現遺傳分化甚大但形態卻沒什麼變異的演化支系，也就是隱蔽支系(cryptic lineages)或隱蔽種(cryptic species)。隱蔽支系在物種界定上的難點在於，如果這些支系是異域分布的，支系間的生殖隔離將會很難評估。這篇研究以澳洲的兩個種群的蜥蜴(Carlia rubrigularis group和Lampropholis coggeri group)為例，種群內的物種是異域或鄰域分布，結論給出一系列界定隱蔽種時的操作建議：

(1) 盡量廣泛採樣擴及各個族群
(2) 做物種界定，找出統計上支持的支系(即putative species或candidate species)
(3) 比較putative species之間有沒有表徵變異，而且這個表徵分化是否與種化有關
(4) 如果(3)失敗了，做生殖隔離相關的實驗
(5) 如果(3)和(4)務實上不可行，則利用已知有生殖隔離的物種間的分化程度(da、dxy、branching time等等)，來評估putative species是否可能也達到生殖隔離

由於生殖隔離的演化在不同支系間可以有很大差異，以上操作尤其是(5)，有一些前提需要考慮。這篇研究提供的操作建議可能比較適用於不同族群間有相似的生態位以及類似的種化過程的種群，因為擁有相近生態位和生物地理背景的種群，支系間的生殖隔離演化速率應該會比較接近。總之好的物種界定應該是process-based的，族群分化史、生態棲位和親緣地理背景等等生物學資訊都應該納入考慮。

一篇allopatric speciation跟它的alternative hypotheses不錯的參考文章：南美的紅胸割草鳥亞種分化

 

https://doi.org/10.1111/jbi.14449

Allopatric divergence常被當作種化的null model，其代表族群間的地理隔離，遺傳分化來自遺傳漂變或local adaptation；而parapatric或sympatric divergence則是alternative model，因為沒有完整的地理隔離所以會涉及基因交流，然後disruptive selection (divergent selection) 導致物種分化，在這個研究中稱作divergence-with-gene-flow model。過去多數探討異域種化的親緣地理學研究只用了中性的基因，然而只有同時檢驗中性和非中性的特徵才能更了解divergence-with-gene-flow在種化和族群分化中扮演的角色是什麼。

分布在南美洲的紅胸割草鳥(Phytotoma rutila)，有兩個亞種：低海拔的rutila和高海拔的angustirostris，它們分布範圍跨越不同環境梯度，而且這兩個亞種不是互為單系群，所以應該是個很適合研究divergence-with-gene-flow和selection如何影響族群分化的物種。這個研究有三個假說：(1) allopatric-speciation model、(2) selection-in-allopatry model和(3) divergence-with-gene-flow model，各自有不同的參數預測，所以作者做了以下計算：

(1) S-test：是否族群的平均表徵演化，不同於遺傳漂變和族群共祖所預測的結果。S=0.5表示隨機的遺傳漂變；S<0.05表示stabilizing selection；S>0.95表示divergent selection。

(2) PST-FST test：比較族群的表徵( PST)和中性遺傳標記(FST)分化，若PST=FST，符合隨機遺傳漂變；若PST>FST，表示divergent selection；若PST<FST，則是stabilizing selection。

(3)絕對(DXY)和相對(FST)的遺傳分化：如果只有遺傳漂變作用，FST會符合卡方分布的預測，DXY也不會呈現顯著差異；若是selection-in-allopatry model，接受選汰壓力的基因將會呈現較高的FST，而DXY則是不受影響或只是略低；若是divergence-with-gene-flow model，因為比起中性的基因，受到選汰的基因以及與其連鎖的基因比較不被基因交流影響，其DXY和FST兩者都會比較高。

結果顯示，兩個亞種三個族群間有不對稱的基因交流、isolation by distance and elevation最能解釋族群間的遺傳變異、表徵的變異大於中性遺傳變異所預期的，因此研究結果符合divergence-with-gene-flow model的預測，地理距離、海拔高度以及對環境梯度的適應都影響了紅胸割草鳥的演化。

亞種也是有不錯的時候

Cicindelidia sedecimpunctata sedecimpunctata

多數時候我認為亞種是個沒什麼意義的單位，至少在表現親緣關係方面是這樣。分類處理是一種假說，因此無論是一個物種的名字還是亞種的名字，都代表著一個假說。但從族群遺傳的角度來看，species和subspecies這兩個假說的預期是一樣的，因為種和亞種共享相同的criteria，例如是不是單系群、有沒有基因交流、是否有可供區別的表徵，因此無論分析結果(pattern)是如何，都難以區別species和subspecies。尤其是近期分化的物種，不見得會呈現單系群和無基因交流，更別說廣為討論的隱蔽種。

不過在某些脈絡下，亞種還蠻好用的。亞種的定義可能很多，不過基本離不開兩個要素：形態變異和地理分布。Patten (2015)對亞種的建議是「a morphologically diagnosably distinct, geographically circumscribed clade that does not form a distinct (neutral) genetic cluster or is not reciprocally monophyletic」，雖然說至今我還沒參透這句話(要如何同時是clade又不是單系群？)，不過至少能看出來亞種這個位階是有形態和地理脈絡的：亞種方便我們辨識不同地理分布的形態型。不同地理分布的形態型，可能代表著niche partition、local adaptation、不同的族群分化史，或者其實根本是不同物種。簡而言之，不只是在系統分類方面，亞種本身就是帶有生物地理脈絡的生態和演化假說。順帶一提，亞種在保育上也有務實幫助，尤其是當我們需要保育種內多樣性的時候，我們需要一個「名字」給掌權者擬定保育相關法律和政策，某些族群可能在科學上過不了正式的species delimitation但卻有獨特的遺傳或適應性特徵，值得被保育，這時候亞種的名字就有積極意義了，有興趣可以參考Coates et al. (2018)的文章。

說這麼多，是因為最近想到似乎可做的議題，分布在北美洲南部至中美洲的虎甲：Cicindelidia sedecimpunctata。其分布範圍從美國的南部經過墨西哥，一路到宏都拉斯和尼加瓜拉。這玩意兒以前被分出許多亞種，不過幾乎都無效了，只剩下一南一北兩個亞種，交界帶在墨西哥的哈利斯科州附近。有趣的是，根據iNaturalist的位點，C. sedecimpunctata的分布似乎是不連續的，位點從美國南部到墨西哥南部然後在特萬特佩克地狹(Isthmus of Tehuantepec)斷開，接著就跳到宏都拉斯和尼加瓜拉。有幾個演化假說也許能解釋，如這是不是一個peripatric divergence的例子？是否特萬特佩克地狹是一個barrier，或扮演filtering dispersal route？然後斷開點和兩個亞種的交界帶不一樣，是否也代表亞種地位應該重新評估？或者還有其它族群隔離的機制？很多細節需要再思考，我先記著這些想法。

南冰洋的陽隧足族群分化史與演化創新

https://doi.org/10.1111/mec.16951

演化創新(evolutionary innovation)普遍定義成一個新特徵的表現，其影響涵蓋行為、生理、形態特徵等等。研究近緣物種間的演化創新有助於理解過去的族群歷史和基因型如何形塑新的特徵。

南冰洋(Southern Ocean)的南極冰帽在第四季冰河期時反覆地擴張和縮小，侵蝕了靠近南極大陸的海床，因此在大冰期的時候南極海底生物不是原地留在沒有冰的庇護所、遷徙到深海就是跑到遠離陸棚的海島。環繞南極分布的兩種近緣陽隧足，Ophionotus victoriae和O. hexactis，前者有五隻觸手和植營性(planktotrophic)的浮游幼體，後者則是六隻觸手和非浮游幼體(brooding)，由於陽隧足多數是五隻觸手和浮游幼體，因此假說是這樣的：O. hexactis如此不同的特徵是一種演化創新而且與適應更新世冰期的庇護所環境有關。

結果發現採自深海(>1000m)的O. victoriae族群呈現很強的基因型和水深的正相關(即isolation by　depth)，可能與曾經長時間待在深海庇護所有關；且StairwayPlot分析指出深海的O. victoriae維持穩定的效族群量直到近代的bottleneck，符合深海庇護所假說的預期。另一方面，StairwayPlot支持採自淺海(<1000m)和南極周邊島嶼的族群呈現bottleneck後的族群擴張，Tajima's D (<0)和Fu's Fs (<0)也支持O. victoriae整體呈現bottleneck後的族群擴張，符合原地(in situ)庇護所和島嶼庇護所假說。至於O. hexactis，不是呈現穩定的有效族群量接著bottleneck，就是族群增長一段時間後接著bottleneck，大致上bottleneck都發生在接近上次冰期的時候，符合原地庇護所假說。

為什麼O. hexactis比人家多長一隻觸手而且幼體非浮游性？作者說可能是因為與間冰期融冰導致的低鹽度、運動協調、避敵策略和冰期時適合的棲地較少有關。這部分感覺是文章重點但也著墨得太少。

最後，這篇文章我不懂的地方太多了，而且讀完後很「意猶未盡」。比如冰期結束後，從這張圖來看這兩種陽隧足的有效族群量似乎都是繼續往下掉的，我不太懂為什麼作者會說呈現bottleneck後的族群擴張。

環形種(ring species)在演化上穩定嗎？

 

https://doi.org/10.1073/pnas.1217034110

一個物種的族群沿著一個地理屏障擴張，在isolation by distance的作用下，環形種(ring speices)就可能會形成。暗綠柳鶯(greenish warblers; Phylloscopus trochiloides)是一個起源於喜馬拉雅山附近、圍著青藏高原分布的環形種，由很多個亞種組成(也有人認為是很多種)，其中兩個分布在西伯利亞的亞種雖然分布重疊，但已經形成生殖隔離。族群分化(differentiation)的速度夠快會因為isolation by distance的作用而產生許多新物種；相反地，較慢的分化速度當然只有一個物種存在。族群擴張和族群分化的速度會最終決定當末端兩個族群二次相遇(secondary contact)時會發生什麼事，較高的環境承載力(carring capacity)會增加擴張速度但降低遺傳分化。這篇研究的作者想檢驗環形種形成的穩定度與持續性，假說是：(1) 在二次相遇的地區如果有較廣的合適棲地，會增加環形種形成的可能性；(2) 環形種最終會分化成好幾個物種還是會合併成同一種。結果方面，模型模擬顯示，如果起源地的面積較大，環形種較不可能形成。另外，多數環形種也是不穩定的，九成的環形種在十三萬個世代後會分化成多個物種或合併回去，對暗綠柳鶯來說會在一萬到五萬年後分化成數個物種。環形種雖然不穩定，但會持續存在一段很長的時間因此可以被觀察到，不過也因為如此所以環形種在自然中不常見。

很有趣的一篇文章，提供了影響環形種化的因子：環中有效的隔離距離、環形分布區域的環境承載力。不過有好多不懂的地方，這篇研究的結果是模型模擬得到的，作者沒給太多生物學上的解釋，為什麼起源地的適合棲地較大的話環形種較難以形成？反之，二次相遇的適合棲地較大則增加環形種形成的可能？目前我還沒有想通。

刷一下存在感，所以迷離虎甲(Cylindera subtilis Chou et al., 2022)登場！

 

https://doi.org/10.1071/IS22011

說實在的這只是一篇小文章，而且是採樣也不算很全的那種。不過這篇也熬了約兩年才發表，做了非常多的分析。除了描述新的分類群，我認為迷離虎甲的發現對於台灣虎甲蟲的多樣性、隱蔽種議題以及更深更廣的，異域種化(allopatric speciation)，有更佳的理解與啟示。

虎甲蟲一般被認為是善飛的昆蟲，移動能力佳的生物通常不會有明顯的族群間的遺傳結構。然而，迷離虎甲的發現代表著兩件事情：(1) 善飛如虎甲的生物也可以發生異域種化(allopatric speciation)，甚至能在很小的地理尺度上形成獨立的遺傳支系(族群間距離不到7公里)；(2) 長頸六星虎甲種群(C. pseudocylindriformis complex)中，些微的形態差異可能暗示種化已經發生了；這代表著台灣的Cylindera屬多樣性還有待發掘，因為這些或多或少的形態細微差異可能都是種級的分化(species-level divergence)。而且，以上兩件事我推測都與棲地專一性和棲位保守性有關。

昆蟲小孩與他們的變態

這是我2016年在Facebook寫的文章，備份來這裡。 

——

最近讀了一篇文章，想起前年昆展時我們被昆蟲的幾種發育方式以及其對應的變態形式困擾很久，當然還有幼生期的名稱。依據不同變態種類，昆蟲的幼期一般有larva (幼蟲)、nymph (若蟲)、naiad (稚蟲)等三種稱呼(先不討論無翅亞綱)，各自有定義，單就昆蟲(Insecta)而言，larva可以專指完全變態類(holometabola)化蛹前的幼體階段，但也有泛指所有昆蟲幼期的用法，無論何種變態；nymph是漸變態類(paurometabola)的幼期名稱；naiad則是較晚近的詞，專指半變態類(hemimetabola，或稱不完全變態)的水生幼期，然而也有人以nymph稱之。

很明顯這三個詞的用法不是一致的，仍有討論空間。內文引用了三篇近期的文獻，首先，Bybee et al. (2015) 整理了larva、nymph、naiad的起源與後來的運用，認為應該遵循前人，主要結論有：1. 昆蟲屬於何種變態以及幼期名稱不必考慮分類系統與同源性；2. larva專指完全變態類的幼期，nymph為成體幼體均棲息相同環境(僅粗略二分為水陸)的漸變態類的幼期，而naiad則是成體陸生的半變態類的水生幼期。看起來挺符合生態與直覺經驗，原則也很簡單。

然後，反駁文章來了。Sahlén et al. (2016) 統計了1986到2015年八月共3968筆資料，發現以larva稱半變態類(即蜻蛉目、蜉蝣目及襀翅目)幼期的最多，其次是nymph，而naiad的使用非常少，三個目總共只占1.8%。因此就詞彙使用的穩定考量來說，larva是最適合的，Sahlén et al. (2016) 也表明會繼續使用larva，尤其是蜻蛉目。Rédei & Štys (2016) 也持反對立場，一一反駁了Bybee et al. (2015) 的論點(真的幾乎是一句句打臉)，認為其結論缺乏生物科學的連結，且語言的使用是會演進的，除了原始用法的優先性，也得考慮後世使用的情況，如nymph一詞原先是pupa(蛹)的同義詞，後來才變成指漸變態類的幼生期。真實的昆蟲變態情形也不如Bybee et al. (2015)所結論的那麼簡單，某些纓翅目和胸吻亞目的幼生期晚期會進入一個靜止、停止攝食的階段，類似完全變態類的蛹，此時蛹的定義便會影響這些類群所屬的發育形式。而且，完全變態類與半變態類的演化及發育關係也有待釐清。因此 Rédei & Štys (2016) 建議讓作者自行決定採用哪一種觀點，而非強制特定用法。

Bybee et al. (2015) 的文章用了很長篇幅來爬梳larva、nymph與naiad的歷史脈絡，我的看法是，在決定使用哪一個詞之前，應該先討論昆蟲的變態種類，隨著已知昆蟲的類群與生態的知識越來越多，以往變態的定義須不須要重新修訂？要不要配合單系群的概念？如果生理研究跟分類系統不一致怎麼辦？在這些釐清之前只用詞源和粗淺的論述下結論，我認為是有點操之過急了，也忽略了昆蟲的多樣性。Sahlén et al. (2016) 以使用的普遍性來反駁立場也可能稍弱，畢竟難免積非成是；Rédei & Štys (2016) 對於變態種類間的關係就有較詳細的討論，接近問題的癥結點。

然而，hemimetabolism (半變態)也許易有岐義，狹義的hemimetabolism是指幼期水生，成體陸生且沒有蛹期的變態形式，廣義的hemimetabolism便是沒有蛹期的變態(不含無翅亞綱)，因此包含paurometabolism和狹義的hemimetabolism。larva和nymph的使用問題也不單關係到變態種類而已，低等白蟻(如鼻白蟻科)有複雜且彈性的階級關係，卵孵化後的階段稱為larva，經幾次蛻皮後成為nymph(有翅芽)，而nymph是個彈性的階段，可以成為有翅型(alate)、前兵蟻(presoldier)進而成為兵蟻(soldier)，甚至是逆回larva階段(Roisin 1988；Korb & Hartfelder 2008)，當蛻皮潛力沒了無法再改變才是adult(如兵蟻)。

在台灣，larva、nymph與naiad的使用習慣上似乎比較符合Bybee et al. (2015)的結論。使用larva來概括所有昆蟲的幼生期應該只是個較為權宜的方法。此外，除了昆蟲，其實larva也會用於描述其他節肢動物與兩棲類的幼體。基於科學講求用詞精確，使名詞能準確對應到更符合現實的演化與發育關係，以後也許會再變動。

先putative species discovery再species validation：從巴西的Pithecopus猴蛙來看物種界定的策略

 

https://doi.org/10.1016/j.ympev.2018.11.022

巴西的大西洋森林(Atlantic Forest)和塞拉多(Cerrado)是當地的陸域生物多樣性熱點，有許多受威脅的特有物種，而且滅絕速率有可能因為隱蔽種的存在被低估了。Pithecopus屬的猴蛙(monkey frog)中的兩個種類：P. megacephalus和P. rohdei，親緣關係近但分布在截然不同的環境，後者有明顯的族群結構並可能有隱蔽種存在，而且這兩個物種的形態多變不好區分，需要重新做物種劃界與分類探討。多基因座數據和溯祖理論是物種界定的好方法，multi-species coalescent (MSC)就是個廣為使用在物種界定的模型，不過MSC常常過度切割物種。所以，使用各種不同的datasets以及了解種化過程很重要，有助理解造成隱蔽多樣性的演化機制。

作者將物種界定的策略分成兩個階段：(1) 首先是species discovery階段，發掘可能的putative species。以BEAST重建粒線體gene tree，再輸入ML-GMYC和bGMYC兩種model找出putative species；接著計算核基因的pairwise haplotype distance，用POFAD的Phylogenetic Bray-Curtis將這些distance合併成一個矩陣，然後再用SplitsTree的Neighbor-Net畫成network圖，用來比較粒線體基因和核基因的物種界定歸群相不相同。(2) 第二個是species validation階段，驗證putative species。把前個階段得到的putative species當成prior輸入BEAST的STACEY套件，做分子物種界定；此外，也使用分子和形態特徵，以iBPP分析整合(integrative)物種界定(A10 model)。

包含P. megacephalus和P. rohdei (由模式產地定義)，GMYC model共找出六個putative species，STACEY和iBPP也支持這個結果。核基因network大致上也得到六個clusters。作者認為新發現的四個支系都屬於P. rohdei complex (而非P. megacephalus)，形質分析(PERMANOVA)顯示只有Doce的族群在形態上與P. rohdei有顯著差異，其餘都是隱蔽支系。

隱蔽支系可能有這四種解釋：近期分化、由於棲位保守導致的形態停滯(morphological stasis due to niche conservatism)、趨同演化和平行演化。根據這些猴蛙的譜系發育關係和分子定年，應該是因為近期分化，還沒有足夠時間累積形態變異。不過作者也不排除其他假說，需要採樣更多外群和定序來確定譜系發育關係，而且這些猴蛙經由鳴聲、費洛蒙等擇偶，可能不會反映在形態上。