令人沮喪的第一次illumina sequencing建庫

記錄一下第一次做illumina squencing的library，為了捕捉UCE loci。因為太令人沮喪了所以覺得該寫下這個歷程，希望之後能找到方法改善。這次用的試劑是xGen DNA Library Prep EZ Kits，主要遇到的問題是cleanup後DNA濃度變得非常低。

有多低？因為我先前有做過ddRADseq library的經驗，老闆請人示範製備過程時主要讓另一位博士生練習，我則在旁邊拿著protocol純觀賞，我的部分樣本就變成示範教材。這是示範製備時的樣本濃度（ng/ul）：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup

ID443    20.6                  3.4
ID448    6.2                    2.1
ID452    8.82                  3.24
ID453    4.88                  5.89
ID439    10.1                  4.4
ID457    7.26                  1.57
ID500    3.08                  1.67

以上是示範教學時的濃度，看起來還不錯所以我就當成標準來參考，結果我自己上陣時變得慘不忍睹：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID444    16.2                  0.596
ID446    7.8                    0.305
ID449    29.2                  0.675
ID450    8.23                  0.345
ID451    18.6                  0.593

為了保護樣本的隱私我只列出一部份，反正一樣慘多說多難過。似乎和起始的gDNA濃度沒關係，最後大家的濃度都低得很平均，會造成DNA流失的步驟只有protocol中的兩次磁珠純化，我看了researchgate上不只有我遇到這個問題（德不孤必有鄰的感覺真好），那大家的建議不外乎就是注意乾燥磁珠的時間要抓好，過乾造成龜裂或不夠乾導致酒精殘留都會影響DNA的回收率。以前我在做ddRADseq建庫時過乾似乎沒造成什麼問題，就是持續pipetting直到磁珠和水混和均勻就好了，至於不夠乾應該是沒遇過畢竟酒精揮發得很快。

目前其實我沒什麼頭緒，我能做的似乎只有縮短乾燥磁珠的時間，還有在步驟間額外插入濃度測量，看看DNA濃度變化是發生在哪一個步驟之後。另外我跑去看官方完整版的protocol後發現也可能是因為gDNA被over fragmented，這就得縮短酵素作用的時間了。等我找到方法成功trobleshooting（如果有那一天的話）再來更新這篇文章吧。

關於隱蔽支系的物種界定務實操作上的建議

 

https://doi.org/10.1093/sysbio/syy026

種化在不同維度上的速率可能是不一樣的，因此會出現遺傳分化甚大但形態卻沒什麼變異的演化支系，也就是隱蔽支系(cryptic lineages)或隱蔽種(cryptic species)。隱蔽支系在物種界定上的難點在於，如果這些支系是異域分布的，支系間的生殖隔離將會很難評估。這篇研究以澳洲的兩個種群的蜥蜴(Carlia rubrigularis group和Lampropholis coggeri group)為例，種群內的物種是異域或鄰域分布，結論給出一系列界定隱蔽種時的操作建議：

(1) 盡量廣泛採樣擴及各個族群
(2) 做物種界定，找出統計上支持的支系(即putative species或candidate species)
(3) 比較putative species之間有沒有表徵變異，而且這個表徵分化是否與種化有關
(4) 如果(3)失敗了，做生殖隔離相關的實驗
(5) 如果(3)和(4)務實上不可行，則利用已知有生殖隔離的物種間的分化程度(da、dxy、branching time等等)，來評估putative species是否可能也達到生殖隔離

由於生殖隔離的演化在不同支系間可以有很大差異，以上操作尤其是(5)，有一些前提需要考慮。這篇研究提供的操作建議可能比較適用於不同族群間有相似的生態位以及類似的種化過程的種群，因為擁有相近生態位和生物地理背景的種群，支系間的生殖隔離演化速率應該會比較接近。總之好的物種界定應該是process-based的，族群分化史、生態棲位和親緣地理背景等等生物學資訊都應該納入考慮。

一篇allopatric speciation跟它的alternative hypotheses不錯的參考文章：南美的紅胸割草鳥亞種分化

 

https://doi.org/10.1111/jbi.14449

Allopatric divergence常被當作種化的null model，其代表族群間的地理隔離，遺傳分化來自遺傳漂變或local adaptation；而parapatric或sympatric divergence則是alternative model，因為沒有完整的地理隔離所以會涉及基因交流，然後disruptive selection (divergent selection) 導致物種分化，在這個研究中稱作divergence-with-gene-flow model。過去多數探討異域種化的親緣地理學研究只用了中性的基因，然而只有同時檢驗中性和非中性的特徵才能更了解divergence-with-gene-flow在種化和族群分化中扮演的角色是什麼。

分布在南美洲的紅胸割草鳥(Phytotoma rutila)，有兩個亞種：低海拔的rutila和高海拔的angustirostris，它們分布範圍跨越不同環境梯度，而且這兩個亞種不是互為單系群，所以應該是個很適合研究divergence-with-gene-flow和selection如何影響族群分化的物種。這個研究有三個假說：(1) allopatric-speciation model、(2) selection-in-allopatry model和(3) divergence-with-gene-flow model，各自有不同的參數預測，所以作者做了以下計算：

(1) S-test：是否族群的平均表徵演化，不同於遺傳漂變和族群共祖所預測的結果。S=0.5表示隨機的遺傳漂變；S<0.05表示stabilizing selection；S>0.95表示divergent selection。

(2) PST-FST test：比較族群的表徵( PST)和中性遺傳標記(FST)分化，若PST=FST，符合隨機遺傳漂變；若PST>FST，表示divergent selection；若PST<FST，則是stabilizing selection。

(3)絕對(DXY)和相對(FST)的遺傳分化：如果只有遺傳漂變作用，FST會符合卡方分布的預測，DXY也不會呈現顯著差異；若是selection-in-allopatry model，接受選汰壓力的基因將會呈現較高的FST，而DXY則是不受影響或只是略低；若是divergence-with-gene-flow model，因為比起中性的基因，受到選汰的基因以及與其連鎖的基因比較不被基因交流影響，其DXY和FST兩者都會比較高。

結果顯示，兩個亞種三個族群間有不對稱的基因交流、isolation by distance and elevation最能解釋族群間的遺傳變異、表徵的變異大於中性遺傳變異所預期的，因此研究結果符合divergence-with-gene-flow model的預測，地理距離、海拔高度以及對環境梯度的適應都影響了紅胸割草鳥的演化。

亞種也是有不錯的時候

Cicindelidia sedecimpunctata sedecimpunctata

多數時候我認為亞種是個沒什麼意義的單位，至少在表現親緣關係方面是這樣。分類處理是一種假說，因此無論是一個物種的名字還是亞種的名字，都代表著一個假說。但從族群遺傳的角度來看，species和subspecies這兩個假說的預期是一樣的，因為種和亞種共享相同的criteria，例如是不是單系群、有沒有基因交流、是否有可供區別的表徵，因此無論分析結果(pattern)是如何，都難以區別species和subspecies。尤其是近期分化的物種，不見得會呈現單系群和無基因交流，更別說廣為討論的隱蔽種。

不過在某些脈絡下，亞種還蠻好用的。亞種的定義可能很多，不過基本離不開兩個要素：形態變異和地理分布。Patten (2015)對亞種的建議是「a morphologically diagnosably distinct, geographically circumscribed clade that does not form a distinct (neutral) genetic cluster or is not reciprocally monophyletic」，雖然說至今我還沒參透這句話(要如何同時是clade又不是單系群？)，不過至少能看出來亞種這個位階是有形態和地理脈絡的：亞種方便我們辨識不同地理分布的形態型。不同地理分布的形態型，可能代表著niche partition、local adaptation、不同的族群分化史，或者其實根本是不同物種。簡而言之，不只是在系統分類方面，亞種本身就是帶有生物地理脈絡的生態和演化假說。順帶一提，亞種在保育上也有務實幫助，尤其是當我們需要保育種內多樣性的時候，我們需要一個「名字」給掌權者擬定保育相關法律和政策，某些族群可能在科學上過不了正式的species delimitation但卻有獨特的遺傳或適應性特徵，值得被保育，這時候亞種的名字就有積極意義了，有興趣可以參考Coates et al. (2018)的文章。

說這麼多，是因為最近想到似乎可做的議題，分布在北美洲南部至中美洲的虎甲：Cicindelidia sedecimpunctata。其分布範圍從美國的南部經過墨西哥，一路到宏都拉斯和尼加瓜拉。這玩意兒以前被分出許多亞種，不過幾乎都無效了，只剩下一南一北兩個亞種，交界帶在墨西哥的哈利斯科州附近。有趣的是，根據iNaturalist的位點，C. sedecimpunctata的分布似乎是不連續的，位點從美國南部到墨西哥南部然後在特萬特佩克地狹(Isthmus of Tehuantepec)斷開，接著就跳到宏都拉斯和尼加瓜拉。有幾個演化假說也許能解釋，如這是不是一個peripatric divergence的例子？是否特萬特佩克地狹是一個barrier，或扮演filtering dispersal route？然後斷開點和兩個亞種的交界帶不一樣，是否也代表亞種地位應該重新評估？或者還有其它族群隔離的機制？很多細節需要再思考，我先記著這些想法。

南冰洋的陽隧足族群分化史與演化創新

https://doi.org/10.1111/mec.16951

演化創新(evolutionary innovation)普遍定義成一個新特徵的表現，其影響涵蓋行為、生理、形態特徵等等。研究近緣物種間的演化創新有助於理解過去的族群歷史和基因型如何形塑新的特徵。

南冰洋(Southern Ocean)的南極冰帽在第四季冰河期時反覆地擴張和縮小，侵蝕了靠近南極大陸的海床，因此在大冰期的時候南極海底生物不是原地留在沒有冰的庇護所、遷徙到深海就是跑到遠離陸棚的海島。環繞南極分布的兩種近緣陽隧足，Ophionotus victoriae和O. hexactis，前者有五隻觸手和植營性(planktotrophic)的浮游幼體，後者則是六隻觸手和非浮游幼體(brooding)，由於陽隧足多數是五隻觸手和浮游幼體，因此假說是這樣的：O. hexactis如此不同的特徵是一種演化創新而且與適應更新世冰期的庇護所環境有關。

結果發現採自深海(>1000m)的O. victoriae族群呈現很強的基因型和水深的正相關(即isolation by　depth)，可能與曾經長時間待在深海庇護所有關；且StairwayPlot分析指出深海的O. victoriae維持穩定的效族群量直到近代的bottleneck，符合深海庇護所假說的預期。另一方面，StairwayPlot支持採自淺海(<1000m)和南極周邊島嶼的族群呈現bottleneck後的族群擴張，Tajima's D (<0)和Fu's Fs (<0)也支持O. victoriae整體呈現bottleneck後的族群擴張，符合原地(in situ)庇護所和島嶼庇護所假說。至於O. hexactis，不是呈現穩定的有效族群量接著bottleneck，就是族群增長一段時間後接著bottleneck，大致上bottleneck都發生在接近上次冰期的時候，符合原地庇護所假說。

為什麼O. hexactis比人家多長一隻觸手而且幼體非浮游性？作者說可能是因為與間冰期融冰導致的低鹽度、運動協調、避敵策略和冰期時適合的棲地較少有關。這部分感覺是文章重點但也著墨得太少。

最後，這篇文章我不懂的地方太多了，而且讀完後很「意猶未盡」。比如冰期結束後，從這張圖來看這兩種陽隧足的有效族群量似乎都是繼續往下掉的，我不太懂為什麼作者會說呈現bottleneck後的族群擴張。

環形種(ring species)在演化上穩定嗎？

 

https://doi.org/10.1073/pnas.1217034110

一個物種的族群沿著一個地理屏障擴張，在isolation by distance的作用下，環形種(ring speices)就可能會形成。暗綠柳鶯(greenish warblers; Phylloscopus trochiloides)是一個起源於喜馬拉雅山附近、圍著青藏高原分布的環形種，由很多個亞種組成(也有人認為是很多種)，其中兩個分布在西伯利亞的亞種雖然分布重疊，但已經形成生殖隔離。族群分化(differentiation)的速度夠快會因為isolation by distance的作用而產生許多新物種；相反地，較慢的分化速度當然只有一個物種存在。族群擴張和族群分化的速度會最終決定當末端兩個族群二次相遇(secondary contact)時會發生什麼事，較高的環境承載力(carring capacity)會增加擴張速度但降低遺傳分化。這篇研究的作者想檢驗環形種形成的穩定度與持續性，假說是：(1) 在二次相遇的地區如果有較廣的合適棲地，會增加環形種形成的可能性；(2) 環形種最終會分化成好幾個物種還是會合併成同一種。結果方面，模型模擬顯示，如果起源地的面積較大，環形種較不可能形成。另外，多數環形種也是不穩定的，九成的環形種在十三萬個世代後會分化成多個物種或合併回去，對暗綠柳鶯來說會在一萬到五萬年後分化成數個物種。環形種雖然不穩定，但會持續存在一段很長的時間因此可以被觀察到，不過也因為如此所以環形種在自然中不常見。

很有趣的一篇文章，提供了影響環形種化的因子：環中有效的隔離距離、環形分布區域的環境承載力。不過有好多不懂的地方，這篇研究的結果是模型模擬得到的，作者沒給太多生物學上的解釋，為什麼起源地的適合棲地較大的話環形種較難以形成？反之，二次相遇的適合棲地較大則增加環形種形成的可能？目前我還沒有想通。

刷一下存在感，所以迷離虎甲(Cylindera subtilis Chou et al., 2022)登場！

 

https://doi.org/10.1071/IS22011

說實在的這只是一篇小文章，而且是採樣也不算很全的那種。不過這篇也熬了約兩年才發表，做了非常多的分析。除了描述新的分類群，我認為迷離虎甲的發現對於台灣虎甲蟲的多樣性、隱蔽種議題以及更深更廣的，異域種化(allopatric speciation)，有更佳的理解與啟示。

虎甲蟲一般被認為是善飛的昆蟲，移動能力佳的生物通常不會有明顯的族群間的遺傳結構。然而，迷離虎甲的發現代表著兩件事情：(1) 善飛如虎甲的生物也可以發生異域種化(allopatric speciation)，甚至能在很小的地理尺度上形成獨立的遺傳支系(族群間距離不到7公里)；(2) 長頸六星虎甲種群(C. pseudocylindriformis complex)中，些微的形態差異可能暗示種化已經發生了；這代表著台灣的Cylindera屬多樣性還有待發掘，因為這些或多或少的形態細微差異可能都是種級的分化(species-level divergence)。而且，以上兩件事我推測都與棲地專一性和棲位保守性有關。

昆蟲小孩與他們的變態

這是我2016年在Facebook寫的文章，備份來這裡。 

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最近讀了一篇文章，想起前年昆展時我們被昆蟲的幾種發育方式以及其對應的變態形式困擾很久，當然還有幼生期的名稱。依據不同變態種類，昆蟲的幼期一般有larva (幼蟲)、nymph (若蟲)、naiad (稚蟲)等三種稱呼(先不討論無翅亞綱)，各自有定義，單就昆蟲(Insecta)而言，larva可以專指完全變態類(holometabola)化蛹前的幼體階段，但也有泛指所有昆蟲幼期的用法，無論何種變態；nymph是漸變態類(paurometabola)的幼期名稱；naiad則是較晚近的詞，專指半變態類(hemimetabola，或稱不完全變態)的水生幼期，然而也有人以nymph稱之。

很明顯這三個詞的用法不是一致的，仍有討論空間。內文引用了三篇近期的文獻，首先，Bybee et al. (2015) 整理了larva、nymph、naiad的起源與後來的運用，認為應該遵循前人，主要結論有：1. 昆蟲屬於何種變態以及幼期名稱不必考慮分類系統與同源性；2. larva專指完全變態類的幼期，nymph為成體幼體均棲息相同環境(僅粗略二分為水陸)的漸變態類的幼期，而naiad則是成體陸生的半變態類的水生幼期。看起來挺符合生態與直覺經驗，原則也很簡單。

然後，反駁文章來了。Sahlén et al. (2016) 統計了1986到2015年八月共3968筆資料，發現以larva稱半變態類(即蜻蛉目、蜉蝣目及襀翅目)幼期的最多，其次是nymph，而naiad的使用非常少，三個目總共只占1.8%。因此就詞彙使用的穩定考量來說，larva是最適合的，Sahlén et al. (2016) 也表明會繼續使用larva，尤其是蜻蛉目。Rédei & Štys (2016) 也持反對立場，一一反駁了Bybee et al. (2015) 的論點(真的幾乎是一句句打臉)，認為其結論缺乏生物科學的連結，且語言的使用是會演進的，除了原始用法的優先性，也得考慮後世使用的情況，如nymph一詞原先是pupa(蛹)的同義詞，後來才變成指漸變態類的幼生期。真實的昆蟲變態情形也不如Bybee et al. (2015)所結論的那麼簡單，某些纓翅目和胸吻亞目的幼生期晚期會進入一個靜止、停止攝食的階段，類似完全變態類的蛹，此時蛹的定義便會影響這些類群所屬的發育形式。而且，完全變態類與半變態類的演化及發育關係也有待釐清。因此 Rédei & Štys (2016) 建議讓作者自行決定採用哪一種觀點，而非強制特定用法。

Bybee et al. (2015) 的文章用了很長篇幅來爬梳larva、nymph與naiad的歷史脈絡，我的看法是，在決定使用哪一個詞之前，應該先討論昆蟲的變態種類，隨著已知昆蟲的類群與生態的知識越來越多，以往變態的定義須不須要重新修訂？要不要配合單系群的概念？如果生理研究跟分類系統不一致怎麼辦？在這些釐清之前只用詞源和粗淺的論述下結論，我認為是有點操之過急了，也忽略了昆蟲的多樣性。Sahlén et al. (2016) 以使用的普遍性來反駁立場也可能稍弱，畢竟難免積非成是；Rédei & Štys (2016) 對於變態種類間的關係就有較詳細的討論，接近問題的癥結點。

然而，hemimetabolism (半變態)也許易有岐義，狹義的hemimetabolism是指幼期水生，成體陸生且沒有蛹期的變態形式，廣義的hemimetabolism便是沒有蛹期的變態(不含無翅亞綱)，因此包含paurometabolism和狹義的hemimetabolism。larva和nymph的使用問題也不單關係到變態種類而已，低等白蟻(如鼻白蟻科)有複雜且彈性的階級關係，卵孵化後的階段稱為larva，經幾次蛻皮後成為nymph(有翅芽)，而nymph是個彈性的階段，可以成為有翅型(alate)、前兵蟻(presoldier)進而成為兵蟻(soldier)，甚至是逆回larva階段(Roisin 1988；Korb & Hartfelder 2008)，當蛻皮潛力沒了無法再改變才是adult(如兵蟻)。

在台灣，larva、nymph與naiad的使用習慣上似乎比較符合Bybee et al. (2015)的結論。使用larva來概括所有昆蟲的幼生期應該只是個較為權宜的方法。此外，除了昆蟲，其實larva也會用於描述其他節肢動物與兩棲類的幼體。基於科學講求用詞精確，使名詞能準確對應到更符合現實的演化與發育關係，以後也許會再變動。

先putative species discovery再species validation：從巴西的Pithecopus猴蛙來看物種界定的策略

 

https://doi.org/10.1016/j.ympev.2018.11.022

巴西的大西洋森林(Atlantic Forest)和塞拉多(Cerrado)是當地的陸域生物多樣性熱點，有許多受威脅的特有物種，而且滅絕速率有可能因為隱蔽種的存在被低估了。Pithecopus屬的猴蛙(monkey frog)中的兩個種類：P. megacephalus和P. rohdei，親緣關係近但分布在截然不同的環境，後者有明顯的族群結構並可能有隱蔽種存在，而且這兩個物種的形態多變不好區分，需要重新做物種劃界與分類探討。多基因座數據和溯祖理論是物種界定的好方法，multi-species coalescent (MSC)就是個廣為使用在物種界定的模型，不過MSC常常過度切割物種。所以，使用各種不同的datasets以及了解種化過程很重要，有助理解造成隱蔽多樣性的演化機制。

作者將物種界定的策略分成兩個階段：(1) 首先是species discovery階段，發掘可能的putative species。以BEAST重建粒線體gene tree，再輸入ML-GMYC和bGMYC兩種model找出putative species；接著計算核基因的pairwise haplotype distance，用POFAD的Phylogenetic Bray-Curtis將這些distance合併成一個矩陣，然後再用SplitsTree的Neighbor-Net畫成network圖，用來比較粒線體基因和核基因的物種界定歸群相不相同。(2) 第二個是species validation階段，驗證putative species。把前個階段得到的putative species當成prior輸入BEAST的STACEY套件，做分子物種界定；此外，也使用分子和形態特徵，以iBPP分析整合(integrative)物種界定(A10 model)。

包含P. megacephalus和P. rohdei (由模式產地定義)，GMYC model共找出六個putative species，STACEY和iBPP也支持這個結果。核基因network大致上也得到六個clusters。作者認為新發現的四個支系都屬於P. rohdei complex (而非P. megacephalus)，形質分析(PERMANOVA)顯示只有Doce的族群在形態上與P. rohdei有顯著差異，其餘都是隱蔽支系。

隱蔽支系可能有這四種解釋：近期分化、由於棲位保守導致的形態停滯(morphological stasis due to niche conservatism)、趨同演化和平行演化。根據這些猴蛙的譜系發育關係和分子定年，應該是因為近期分化，還沒有足夠時間累積形態變異。不過作者也不排除其他假說，需要採樣更多外群和定序來確定譜系發育關係，而且這些猴蛙經由鳴聲、費洛蒙等擇偶，可能不會反映在形態上。

明顯分群的粒線體支系應該視為不同物種嗎？看看蠼螋的例子

https://doi.org/10.1093/zoolinnean/zlaa070

"Speciation processes are not necessarily followed by morphological diversification."
喜歡這個句子，先記著。

對的，種化不見得伴隨形態上的分化，尤其在近緣種之間更可能缺乏診斷特徵(diagnostic characters)。所以分子方法可以幫助分類學的研究，找出隱蔽種。DNA條碼是個廣泛使用的概念與工具，動物來說常使用粒線體COI基因。不過，COI重建的gene tree如果有明顯的遺傳結構，那這些遺傳支系應該在分類上當成不同物種嗎？

Forficula auricularia是一種廣布的蠼螋，前人已經分析過COI並認為至少有兩個隱蔽種。本研究的目的是：(1) 劃界F. auricularia complex的親緣地理，並用核基因ITS2偵測各COI支系之間有沒有基因交流；(2) 藉由形質分析看看這些COI支系是不是隱蔽種，或其實是形態上可辨別的物種；(3) 評估各支系間的氣候棲位(climate niche)。結果顯示共有五個粒線體支系(A、B、C、D、E)，ABCE的形態高度保守，只有D可以在形質分析中區分。ITS2的單倍型分析中，A和E有各自獨特的單倍型，而B和D的單倍型基本上一樣，C則缺少核基因的數據。ABE沒有共享的ITS2單倍型，因此應該沒有基因交流，於是作者認為他們是三個獨立的演化支系(本篇研究中，即species)。至於D，分布非常侷限而且沒有和他的姊妹支系B相連，反而是被廣布的E包圍，而且D的形態和其他支系差異最大，所以作者也認為D是一個獨立物種。最後D和E被描述成兩個新種。

其實我最想知道的是A和C的關係。他們在COI樹上是姊妹支系，而且地理分布相隔很遠，A廣布在歐洲和北美，而C似乎只有在伊朗採集到。可惜的是C沒有核基因資料，也沒有納入形質和棲位分析，作者也認為需要多點樣本來探討C的地位，所以目前先將C視為A，即F. auricularia，種內的一個支系。所以，不同粒線體支系應該視為不同物種嗎？利用不同的dataset，如這個研究使用核基因、形質和氣候棲位三種dataset，獨立分析後如果可以得到和粒線體支系相同的分群，那麼這些支系視為不同種應該沒問題，至少有演化與生態上的意義。

空間如何影響種化？Psorodonotus跳跳的邊域分布與budding speciation

https://doi.org/10.1111/zsc.12174

生態學家和族群遺傳學家根據Mayr (1942)的系統，通常將生物的空間分布分成四種：異域(allopatry)、同域(sympatry)、邊域(peripatry)還有鄰域(parapatry)。分類學家和譜系發育學家也從演化產物間的關係來定義四類種化過程：cladogenetic speciation (分支種化，祖先種產生一或兩個後裔種的二叉式演化)、anagenetic speciation (線性種化，祖先種經過漸變過程產生一個後裔種)、hybrid speciation (雜交種化，兩個祖先族群的融合)和budding speciation (出芽種化，邊域族群和仍現存的祖先族群產生分化)。

邊域分布指的是一個小族群與母族群分開，比如島嶼族群和大陸族群的關係，或本研究的例子是各山頭上的sky-island族群。budding speciation是一個邊域族群由於創始者效應(founder effect)、遺傳漂變(genetic drift)以及其他生態條件而與祖先族群快速分化開，變成bud species的過程。可以從這些特徵來判斷：(1) 祖先族群和邊域族群的地理範圍和族群大小是不對稱的；(2) 邊域族群理論上分布受限且族群量會比較小，所以會有明顯的founder effect和genetic drift；(3) 祖先種在gene tree上是併系群(paraphyly)。

西亞地區有一群偏好中高海拔棲地、Psorodonotus屬的跳跳，其中，P. venosus group (PVG，還有P. tendurek、P. hakkari、P. rugulosus共四個種)裡只有P. venosus是廣布的，其他種類都是侷限分布，可能跟冰期動態有關，因此很適合做為研究budding speciation的材料，以及更新世冰期如何影響這群跳跳的種化。根據實驗結果，PVG的地理分布與形態和genetic clustering相關，但搭不上粒線體基因重建的親緣關係。作者認為P. venosus是祖先種，遺傳多樣性較高；其他三種跳跳是bud species，遺傳多樣性低而且有創始者效應和遺傳漂變的訊號。分布於阿爾達漢高原(Ardahan Plateau)的PVG共祖起源於2.05-2.94百萬年前，接著因為冰期而經歷族群擴張、間冰期而退縮回到山頂，邊域族群便與祖先族群分化開來。但這段過程中邊域族群也和祖先族群反覆分分合合，沒有完全阻斷基因交流。

支序學觀點下，budding speciation的gene tree會一直呈現併系群，直到祖先種又再分化出更多新種為止。不過，祖先種變成單系群似乎不太可能，因為傳承自祖先的等位基因(allele)一直保留著。PVG的種化過程伴隨祖先種和bud species間的遺傳滲漏(genetic introgression)，這個基因交流夠顯著讓祖先種難以變成單系群。