實驗室meeting是為了什麼？

多數實驗室應該都有定期的meeting吧，內容不外乎就是進度報告和文獻報告，頻率依實驗室PI的偏好而定，通常每週一次或每兩週一次。

不過最近我開始有這是為了做而做的感覺。讀過研究所的人應該都曉得，研究進度通常不是穩定前進的，而是累積一段時間後才往前長（或後退）一點點，因此每週都要有進度可以報告似乎不太實際，比如說我在做的基因體學和貝氏推論的東西超花時間的，要跑出一個可用的結果大概就超過一週了，那我的進度報告就只會是「程式還在跑」。如果實驗室的人夠多可以輪流報告倒是還好，大家還可以一起集思廣益和troubleshooting。

那文獻報告呢？可以多吸收一點新知很不錯，同個實驗室的同事有興趣的領域通常也很接近。但真的是這樣嗎？一個領域裡面其實還會再分支出好幾個子領域，一樣以我待的領域來說，我有興趣的是族群層級的分子演化和種化，所以我讀paper也是以這個為準則，也更符合我的研究需求。我的一個同事理論上跟我一樣是做族群層級的，但他每次挑的paper都是更高層級的大尺度生物地理，我就很好奇他讀的文獻有沒有幫助到他的論文，主觀上我也常覺得他選的文獻偏無聊（不是領域問題，是文章本身對我而言沒賣點；或許他也覺得我選的很無聊）。

此外我老闆還額外舉辦了讀書會，和實驗室meeting隔週舉行，然後邀請其它實驗室的人一起參與。原本讀書會是三週一次，這學期頻率變高了變成兩週一次。同個實驗室裡都可能有歧異了，更何況不同實驗室的，上學期的尷尬感還像昨天剛發生一樣，有次paper是我挑的，結果受邀的十多人中含我只有三個人到場，還有次更傻眼，只有四個人來但挑paper的人自己缺席。其實就是大家沒那麼有興趣吧，不懂為何這學期還可以提高meeting的頻率。

完全取消實驗室meeting好像又哪裡不對，那怎麼做才是有意義的meeting呢？我的想法是，自己實驗室盡量自己meeting就好（雖然讀書會不是lab meeting，但我們實驗室的lab meeting也只是在討論paper，兩者本質一樣），頻率不用高約兩週一次就很適合，然後主題可以多樣一點，比如說workshop，大家能交流新學了什麼分析，總比自己摸但不知道對還錯來的好。不然，大家應該也沒那麼喜歡開會吧？

令人沮喪的第一次illumina sequencing建庫 (20250219更新troubleshooting)

記錄一下第一次做illumina squencing的library，為了捕捉UCE loci。因為太令人沮喪了所以覺得該寫下這個歷程，希望之後能找到方法改善。這次用的試劑是xGen DNA Library Prep EZ Kits，主要遇到的問題是cleanup後DNA濃度變得非常低。

有多低？因為我先前有做過ddRADseq library的經驗，老闆請人示範製備過程時主要讓另一位博士生練習，我則在旁邊拿著protocol純觀賞，我的部分樣本就變成示範教材。這是示範製備時的樣本濃度（ng/ul）：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup

ID443    20.6                  3.4
ID448    6.2                    2.
ID452    8.82                  3.24
ID453    4.88                  5.89
ID439    10.1                  4.4
ID457    7.26                  1.57
ID500    3.08                  1.67

以上是示範教學時的濃度，看起來還不錯所以我就當成標準來參考，結果我自己上陣時變得慘不忍睹：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID444    16.2                  0.596
ID446    7.8                    0.305
ID449    29.2                  0.675
ID450    8.23                  0.345
ID451    18.6                  0.593

為了保護樣本的隱私我只列出一部份，反正一樣慘多說多難過。似乎和起始的gDNA濃度沒關係，最後大家的濃度都低得很平均，會造成DNA流失的步驟只有protocol中的兩次磁珠純化，我看了researchgate上不只有我遇到這個問題（德不孤必有鄰的感覺真好），那大家的建議不外乎就是注意乾燥磁珠的時間要抓好，過乾造成龜裂或不夠乾導致酒精殘留都會影響DNA的回收率。以前我在做ddRADseq建庫時過乾似乎沒造成什麼問題，就是持續pipetting直到磁珠和水混和均勻就好了，至於不夠乾應該是沒遇過畢竟酒精揮發得很快。

目前其實我沒什麼頭緒，我能做的似乎只有縮短乾燥磁珠的時間，還有在步驟間額外插入濃度測量，看看DNA濃度變化是發生在哪一個步驟之後。另外我跑去看官方完整版的protocol後發現也可能是因為gDNA被over fragmented，這就得縮短酵素作用的時間了。等我找到方法成功trobleshooting（如果有那一天的話）再來更新這篇文章吧。

———20250219更新———

成功找到導致最後濃度極低的原因了，就只是我自己犯蠢拿錯了elution buffer。其實protocol上有寫清楚需要的是10mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)，但是我拿到了1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)，酸鹼值的不同可能會讓反應酵素失活之類的。啊不過我同事說他之前也用跟我一樣的buffer好像就沒出什麼事，這點我不知道所以先保留，可能是他記錯或不同物種導致的差異。總之換了正確的buffer後，我得到了不錯的建庫結果：

             conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID523    4.83                    24
ID524    3.21                    18.5
ID525    6                         25.7
ID526    11                       26.1
ID527    14.9                    42.2 (稀釋1.5倍後的濃度，原本太高了Qubit測不出來)

就是這樣，之前在找資料時我在ResearchGate之類的網站發現有些人也遇過類似的問題（德不孤必有鄰的感覺真好），像是建庫時DNA濃度突然驟減、拿到錯誤濃度的elution buffer怎麼辦之類的，他們的情形有可能跟我一樣，希望我的經驗可以給大家一點在troubleshooting時的想法。

亞種也是有不錯的時候

Cicindelidia sedecimpunctata sedecimpunctata

多數時候我認為亞種是個沒什麼意義的單位，至少在表現親緣關係方面是這樣。分類處理是一種假說，因此無論是一個物種的名字還是亞種的名字，都代表著一個假說。但從族群遺傳的角度來看，species和subspecies這兩個假說的預期是一樣的，因為種和亞種共享相同的criteria，例如是不是單系群、有沒有基因交流、是否有可供區別的表徵，因此無論分析結果（patterns）是如何，都難以區別species和subspecies。尤其是近期分化的物種，不見得會呈現單系群和無基因交流，更別說廣為討論的隱蔽種。

不過在某些脈絡下，亞種還蠻好用的。亞種的定義可能很多，不過基本離不開兩個要素：形態變異和地理分布。Patten (2015)對亞種的建議是「a morphologically diagnosably distinct, geographically circumscribed clade that does not form a distinct (neutral) genetic cluster or is not reciprocally monophyletic」，雖然說至今我還沒參透這句話（要如何同時是clade又不是單系群？），不過至少能看出來亞種這個位階是有形態和地理脈絡的：亞種方便我們辨識不同地理分布的形態型。不同地理分布的形態型，可能代表著niche partition、local adaptation、不同的族群分化史，或者其實根本是不同物種。簡而言之，不只是在系統分類方面，亞種本身就自帶生物地理的脈絡。順帶一提，亞種在保育上也有務實幫助，尤其是當我們需要保育種內多樣性的時候，我們需要一個「名字」給掌權者擬定保育相關法律和政策，某些族群可能在科學上過不了正式的species delimitation但卻有獨特的遺傳或適應性特徵，值得被保育，這時候亞種的名字就有積極意義了，有興趣可以參考Coates et al. (2018)的文章。

說這麼多，是因為最近想到似乎可做的議題，分布在北美洲南部至中美洲的虎甲：Cicindelidia sedecimpunctata。其分布範圍從美國的南部經過墨西哥，一路到宏都拉斯和尼加瓜拉。這玩意兒以前被分出許多亞種，不過幾乎都無效了，只剩下一南一北兩個亞種，交界帶在墨西哥的哈利斯科州附近。有趣的是，根據iNaturalist的位點，C. sedecimpunctata的分布似乎是不連續的，位點從美國南部到墨西哥南部然後在特萬特佩克地狹（Isthmus of Tehuantepec）斷開，接著就跳到宏都拉斯和尼加瓜拉。有幾個演化假說也許能解釋，如這是不是一個peripatric divergence的例子？是否特萬特佩克地狹是一個barrier，或扮演filtering dispersal route？然後斷開點和兩個亞種的交界帶不一樣，是否也代表亞種地位應該重新評估？或者還有其它族群隔離的機制？很多細節需要再思考，我先記著這些想法。

昆蟲小孩與他們的變態

這是我2016年在Facebook寫的文章，備份來這裡。 

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最近讀了一篇文章，想起前年昆展時我們被昆蟲的幾種發育方式以及其對應的變態形式困擾很久，當然還有幼生期的名稱。依據不同變態種類，昆蟲的幼期一般有larva（幼蟲）、nymph（若蟲）、naiad（稚蟲）等三種稱呼（先不討論無翅亞綱），各自有定義，單就昆蟲而言，larva可以專指完全變態類（holometabola）化蛹前的幼體階段，但也有泛指所有昆蟲幼期的用法，無論何種變態；nymph是漸變態類（paurometabola）的幼期名稱；naiad則是較晚近的詞，專指半變態類（hemimetabola，或稱不完全變態）的水生幼期，然而也有人以nymph稱之。

很明顯這三個詞的用法不是一致的，仍有討論空間。內文引用了三篇近期的文獻，首先，Bybee et al. (2015) 整理了larva、nymph、naiad的起源與後來的運用，認為應該遵循前人，主要結論有：1. 昆蟲屬於何種變態以及幼期名稱不必考慮分類系統與同源性；2. larva專指完全變態類的幼期，nymph為成體幼體均棲息相同環境(僅粗略二分為水陸)的漸變態類的幼期，而naiad則是成體陸生的半變態類的水生幼期。看起來挺符合生態與直覺經驗，原則也很簡單。

然後，反駁文章來了。Sahlén et al. (2016) 統計了1986到2015年八月共3968筆資料，發現以larva稱半變態類(即蜻蛉目、蜉蝣目及襀翅目)幼期的最多，其次是nymph，而naiad的使用非常少，三個目總共只占1.8%。因此就詞彙使用的穩定考量來說，larva是最適合的，Sahlén et al. (2016) 也表明會繼續使用larva，尤其是蜻蛉目。Rédei & Štys (2016) 也持反對立場，一一反駁了Bybee et al. (2015) 的論點(真的幾乎是一句句打臉)，認為其結論缺乏生物科學的連結，且語言的使用是會演進的，除了原始用法的優先性，也得考慮後世使用的情況，如nymph一詞原先是pupa(蛹)的同義詞，後來才變成指漸變態類的幼生期。真實的昆蟲變態情形也不如Bybee et al. (2015)所結論的那麼簡單，某些纓翅目和胸吻亞目的幼生期晚期會進入一個靜止、停止攝食的階段，類似完全變態類的蛹，此時蛹的定義便會影響這些類群所屬的發育形式。而且，完全變態類與半變態類的演化及發育關係也有待釐清。因此 Rédei & Štys (2016) 建議讓作者自行決定採用哪一種觀點，而非強制特定用法。

Bybee et al. (2015) 的文章用了很長篇幅來爬梳larva、nymph與naiad的歷史脈絡，我的看法是，在決定使用哪一個詞之前，應該先討論昆蟲的變態種類，隨著已知昆蟲的類群與生態的知識越來越多，以往變態的定義須不須要重新修訂？要不要配合單系群的概念？如果生理研究跟分類系統不一致怎麼辦？在這些釐清之前只用詞源和粗淺的論述下結論，我認為是有點操之過急了，也忽略了昆蟲的多樣性。Sahlén et al. (2016) 以使用的普遍性來反駁立場也可能稍弱，畢竟難免積非成是；Rédei & Štys (2016) 對於變態種類間的關係就有較詳細的討論，接近問題的癥結點。

然而，hemimetabolism（半變態）也許易有岐義，狹義的hemimetabolism是指幼期水生，成體陸生且沒有蛹期的變態形式，廣義的hemimetabolism便是沒有蛹期的變態（不含無翅亞綱），因此包含paurometabolism和狹義的hemimetabolism。larva和nymph的使用問題也不單關係到變態種類而已，低等白蟻（如鼻白蟻科）有複雜且彈性的階級關係，卵孵化後的階段稱為larva，經幾次蛻皮後成為nymph（有翅芽），而nymph是個彈性的階段，可以成為有翅型（alate）、前兵蟻（presoldier）進而成為兵蟻（soldier），甚至是逆回larva階段(Roisin 1988；Korb & Hartfelder 2008)，當蛻皮潛力沒了無法再改變才是adult（如兵蟻）。

在台灣，larva、nymph與naiad的使用習慣上似乎比較符合Bybee et al. (2015)的結論。使用larva來概括所有昆蟲的幼生期應該只是個較為權宜的方法。此外，除了昆蟲，其實larva也會用於描述其他節肢動物與兩棲類的幼體。基於科學講求用詞精確，使名詞能準確對應到更符合現實的演化與發育關係，以後也許會再變動。

在甲仙鏽虎甲和金商虎甲發表之後

 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6751220/

這篇文章是我的第一篇學術論文，描述了兩個新分類群：甲仙芋頭鏽虎甲（Cylindera ooa Chou & Yeh, 2019）和金商虎甲（Cylindera autumnalis Chou & Yeh, 2019）。想當初是在擔心有競爭者的情況下拚出來的，所幸去年順利發表了，可喜可賀。不過發表了之後呢？我想來思考怎麼寫系統分類學的文章會更好。

我大致是圍繞著這個思想在寫文章的：我今天採到了新材料，該如何檢驗他們是不是新種？

假說如果是指「對某個現象的可驗證的暫時解釋」，因此一棵演化樹是一個假說（解釋taxa間的演化關係），是或不是新種應該也可以是一個假說。現在我就要來驗證它。幸運的是，臺灣的虎甲蟲大多是特有種，近緣種也大多分布在臺灣，所以就這篇文章的脈絡下不用擔心國外樣本的問題。好，我採到了兩類新標本，根據形態相似度可以找到他們各自的putative sister species，都是產於臺灣的特有種，在研究中我將他們分成sauteri group和pseudocylindriformis group，方便比較也方便稱呼。接著用DNA資料做親緣分析、比較一些形態特徵。concatenated analysis支持我的新樣本是單系群，也與近緣種之間存在穩定的形態差異，於是文章的結論描述了兩個新種。

談談哪裡寫得不好吧，今天再來看這篇文章，我覺得以下幾點可以改進：

1. 不該在前言談結論。前言是敘述「已知資訊」的段落，我認為觀察、文獻回顧、分析前可得的訊息都算是已知資訊，但在前言就說有兩個新種要描述邏輯超奇怪的，這不是經過實驗、分析、討論後才會得到的結論嗎？我知道很多文章都會在前言就提到要寫新種，而我的觀點是新種描述應該寫在conclusion或discussion之後，因為results應該是經由materials and methods得到的客觀成果，再經由discussion的論證、解釋之後才會得到「為什麼是新種」的結論。如果往後有更多樣本、不同觀點、不同分析方式說不定新種的解釋就改變了啊，或是至少寫在results。總之不要在前言預知結論才該出現的東西，不過我記得是我的advisor要我這樣寫的啦哈哈(甩鍋

2. 測量體長的方法不好。當時我在思考要怎麼量體長比較客觀，參考一些虎甲的分類文章可以發現多數表達體長的方式都是body length without labrum，什麼意思？大概是從頭量到翅鞘末端但不包含上唇，從頭的哪裡？不曉得。如何避免抬頭低頭造成的誤差？不曉得。虎甲小小一隻差一點點可能就差很多了，可是這些文章都沒仔細說明怎麼量體長的，於是我索性不量頭長，用前胸背板到翅鞘末端的長度來代表體長。不過最近我想到了更好的方法，就是從額(frons)和頭楯(clypeus)的接縫開始量到翅鞘末端，這點留到以後的文章改進。

3. 物種觀不明確。我是想採用親緣種觀（phylogenetic species concept）和模式種觀（typological species concept）啦，這是一篇探討新種的研究，應該在文章裡聊聊自己的物種觀。

4. 棲位分化的討論有點無稽。系統分類的研究帶入一點演化故事確實會有趣得多，也比較會有人想讀。共域的近緣虎甲（related species in sympatry）的體長和大顎長度可能代表著不同的資源利用與棲位分割，並與種化過程有關（因果關係還不好說），但但但我的研究裡的sister species之間並沒發現有共域，反而關係較遠的C. ooa和C. pseudocylindriformis會共域，這樣種化與分佈現況就不好用形態變異與棲位分化解釋了，也有可能是因為地理隔閡、族群擴張、競爭排擠造成的啊，缺乏證據下從體長差異到棲位分化還有段距離，還不如當初直接寫純分類文章就好。總之我也不知道我在寫什麼，就當提了個新假說吧。

最後，文章脈絡我仍是像許多分類文章一樣，從某某分類群有多少種、臺灣已知多少種、常用什麼特徵、有什麼分類問題到研究目的和策略，然後談談新種的發現對這個類群的系統分類和演化有什麼意義。這是我的出道作，希望有天我可以跳脫這個模板，從演化故事切入。