令人沮喪的第一次illumina sequencing建庫 (20250219更新troubleshooting)

記錄一下第一次做illumina squencing的library，為了捕捉UCE loci。因為太令人沮喪了所以覺得該寫下這個歷程，希望之後能找到方法改善。這次用的試劑是xGen DNA Library Prep EZ Kits，主要遇到的問題是cleanup後DNA濃度變得非常低。

有多低？因為我先前有做過ddRADseq library的經驗，老闆請人示範製備過程時主要讓另一位博士生練習，我則在旁邊拿著protocol純觀賞，我的部分樣本就變成示範教材。這是示範製備時的樣本濃度（ng/ul）：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup

ID443    20.6                  3.4
ID448    6.2                    2.
ID452    8.82                  3.24
ID453    4.88                  5.89
ID439    10.1                  4.4
ID457    7.26                  1.57
ID500    3.08                  1.67

以上是示範教學時的濃度，看起來還不錯所以我就當成標準來參考，結果我自己上陣時變得慘不忍睹：

            conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID444    16.2                  0.596
ID446    7.8                    0.305
ID449    29.2                  0.675
ID450    8.23                  0.345
ID451    18.6                  0.593

為了保護樣本的隱私我只列出一部份，反正一樣慘多說多難過。似乎和起始的gDNA濃度沒關係，最後大家的濃度都低得很平均，會造成DNA流失的步驟只有protocol中的兩次磁珠純化，我看了researchgate上不只有我遇到這個問題（德不孤必有鄰的感覺真好），那大家的建議不外乎就是注意乾燥磁珠的時間要抓好，過乾造成龜裂或不夠乾導致酒精殘留都會影響DNA的回收率。以前我在做ddRADseq建庫時過乾似乎沒造成什麼問題，就是持續pipetting直到磁珠和水混和均勻就好了，至於不夠乾應該是沒遇過畢竟酒精揮發得很快。

目前其實我沒什麼頭緒，我能做的似乎只有縮短乾燥磁珠的時間，還有在步驟間額外插入濃度測量，看看DNA濃度變化是發生在哪一個步驟之後。另外我跑去看官方完整版的protocol後發現也可能是因為gDNA被over fragmented，這就得縮短酵素作用的時間了。等我找到方法成功trobleshooting（如果有那一天的話）再來更新這篇文章吧。

———20250219更新———

成功找到導致最後濃度極低的原因了，就只是我自己犯蠢拿錯了elution buffer。其實protocol上有寫清楚需要的是10mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)，但是我拿到了1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)，酸鹼值的不同可能會讓反應酵素失活之類的。啊不過我同事說他之前也用跟我一樣的buffer好像就沒出什麼事，這點我不知道所以先保留，可能是他記錯或不同物種導致的差異。總之換了正確的buffer後，我得到了不錯的建庫結果：

             conc. of gDNA    conc. after PCR and cleanup
ID523    4.83                    24
ID524    3.21                    18.5
ID525    6                         25.7
ID526    11                       26.1
ID527    14.9                    42.2 (稀釋1.5倍後的濃度，原本太高了Qubit測不出來)

就是這樣，之前在找資料時我在ResearchGate之類的網站發現有些人也遇過類似的問題（德不孤必有鄰的感覺真好），像是建庫時DNA濃度突然驟減、拿到錯誤濃度的elution buffer怎麼辦之類的，他們的情形有可能跟我一樣，希望我的經驗可以給大家一點在troubleshooting時的想法。